Salt-Inducible Kinase 1 is a potential therapeutic target in Desmoplastic Small Round Cell Tumor (2022)

https://doi.org/10.1038/s41389-022-00395-6

 

연구 배경

Desmoplastic Small Round Cell Tumor(DSRCT) 는 복막(배 안쪽의 얇은 막)에서 발생하는 매우 희귀하고 공격적인 암으로, 주로 청소년과 젊은 성인에게서 나타난다. 종양은 복강 내 여러 부위에 작은 결절 형태로 퍼지며, 간·비장 등으로 전이되는 경우가 많다. 현재 치료는 수술, 고용량 항암, 방사선 치료를 모두 병행하는 극도로 공격적인 방식이지만, 그럼에도 불구하고 진단 후 5년 생존율이 5~30%에 불과하다.

 

이 암의 근본적인 원인은 염색체 전위 t(11;22)(p13;q12) 에 의해 만들어지는 EWSR1-WT1 융합 유전자이다. 이 유전자는 Ewing 육종(EWSR1)에서 유래한 강력한 전사활성 도메인과, Wilms 종양 억제유전자(WT1)의 DNA 결합 도메인이 결합된 형태다. 즉, 본래 종양 억제 역할을 하던 WT1이 EWSR1의 활성화 도메인과 결합하면서 오히려 종양 촉진 단백질로 변한 것이다.

 

EWSR1-WT1은 두 가지 형태의 스플라이싱 변이를 가진다.

• EWSR1-WT1(-KTS) : 3번째와 4번째 아연손가락 사이에 KTS(리신-트레오닌-세린) 서열이 없는 형태

• EWSR1-WT1(+KTS) : KTS 서열이 삽입된 형태

이 두 형태는 서로 다른 DNA 서열을 인식하며, 종양 유발 능력 또한 다르다. 실험적으로는 -KTS형이 암화(transformation)를 유도하지만, +KTS형은 그렇지 않았다. 문제는 이 융합 단백질이 수많은 하위 유전자를 비정상적으로 조절하면서도, 직접적으로 어떤 경로를 통해 암 성장을 유도하는지 명확히 규명된 적이 없었다는 점이다.

 

연구 설계 및 분석 과정

• 목표: EWSR1-WT1 융합 단백질이 직접 조절하는 유전자를 찾아 DSRCT 치료 표적을 규명하고자 했다.

• 접근법:

  • EWSR1-WT1 억제(shRNA)를 통해 발현이 감소하는 유전자 탐색

  • DSRCT 환자 종양 데이터와 비교 분석

  • 두 데이터에서 공통적으로 활성화된 유전자 추출

  • GO 분석으로 DSRCT 특이적으로 증가한 인산화효소군 확인

• 결과: SIK1(Salt-Inducible Kinase 1) 이 DSRCT에서 가장 강하게 활성화된 인산화효소로 나타났다.

 

SIK1의 DSRCT 특이적 발현

• DSRCT, Ewing sarcoma, alveolar rhabdomyosarcoma, synovial sarcoma, ASPS 등 여러 육종 간 발현 비교
  → SIK1만이 DSRCT에서 특이적으로 고발현됐다.

• 다른 SIK 계열 효소(SIK2, SIK3)는 발현 차이가 없었다.

• EWSR1-WT1의 기존 표적(FGFR4, PDGFA, PDGFRB, NTRK3 등)과 함께 SIK1도 주요 활성 유전자로 포함됐다.

• 인간 유전체 상 SIK1 복제 여부 확인 결과
  → SIK1B는 가짜 중복으로 밝혀졌으며, DSRCT에서는 실제로 단일 SIK1 유전자만 존재했다.

 

EWSR1-WT1이 SIK1 발현을 직접 조절함

• SIK1의 2kb 프로모터 영역에서 EWSR1-WT1(-KTS), (+KTS) 결합 서열 발견

• ChIP 분석 결과

  • EWSR1-WT1 단백질이 SIK1 프로모터 특정 부위에 직접 결합

  • 결합 부위에서 SNP(단일염기다형성) 확인

• 루시퍼레이스 리포터 실험 결과

  • EWSR1-WT1(-KTS)이 SIK1 프로모터를 강하게 활성화

  • (+KTS)은 활성 효과가 약했음

• 정상 중피세포(LP9)에서도 동일한 결과 관찰됨
  → EWSR1-WT1(-KTS) → SIK1 발현 직접 유도가 명확히 확인됐다.

 

SIK1의 기능 검증: DSRCT 세포 생존에 필수

• DSRCT 세포주(JN, BER)에 siRNA로 EWSR1-WT1 또는 SIK1을 각각 억제

  • EWSR1-WT1 억제 시 세포 생존율 50%↓

  • SIK1 억제 시 동일한 수준의 감소

  • Ewing sarcoma 세포(A673)는 큰 변화 없음 → DSRCT 특이적 의존성

• Doxycycline 유도형 shSIK1 세포주 제작

  • SIK1 발현 감소 시 세포 성장 억제 확인

  • EWSR1-WT1 억제 효과와 동일한 수준으로 세포 성장 정지

 

세포주기 및 DNA 복제 분석

• SIK1 억제 시 세포주기 G1/S 전이에서 정지

  • DNA 복제 개시가 이루어지지 않음

  • Cyclin E 발현이 일정하게 유지되어 세포주기 전진이 차단됨

• RNA-seq 및 microarray 공통 분석 결과

  • EWSR1-WT1 및 SIK1 억제 시 공통적으로 변화하는 유전자군 확인

  • 공통으로 억제된 상위 경로: Cell cycle control of chromosomal replication

• EdU 염색 분석

  • SIK1 억제 세포에서 EdU 양성률 급감 → DNA 복제 거의 정지

• 인산화 분석

  • MCM2 단백질의 S27, S41 인산화 감소

  • 총 MCM2 단백질 양도 감소 → 복제 헬리케이스 복합체 비활성화

  • 이는 SIK1이 DNA 복제 개시에서 MCM2를 조절함을 의미한다.

 

생체 내 실험 (Xenograft 모델)

• SIK1 억제 세포(shSIK1 DSRCT)를 면역결핍 마우스(NSG)에 주입

• Doxycycline 투여로 SIK1 발현 억제 유도

• 결과

  • 종양 성장 속도 현저히 감소

  • 체중 변화 및 독성 없음

  • EdU 염색에서 DNA 복제 세포 비율 급감

• 결론: SIK1 억제는 생체 내에서도 DSRCT 종양의 DNA 복제 및 성장을 멈추게 한다.

 

약물 실험: SIK1 억제제 단독 및 병용 효과

• 선택적 SIK1 억제제가 없어 pan-SIK 억제제 YKL-05-099 사용

• DSRCT 세포 반응

  • BER 세포에서 IC₅₀ ≈ 3.5 µM

  • JN 세포는 상대적으로 내성

• DNA 복제 스트레스 관련 단백질 CHEK1 억제제(Prexasertib) 병용 실험 수행

  • CHEK1은 DNA 손상 복구 경로에 관여

• 병용 결과:

  • 단독 사용보다 세포 생존률 절반 이하로 감소

  • 특히 BER 세포에서 강력한 시너지 효과

  • 정상 LP9 세포에서는 큰 영향 없음

• 해석

  • SIK1 억제로 DNA 복제 스트레스 유발

  • CHEK1 억제로 복구 차단 → 이중 차단 효과로 세포 사멸 증가

 

 

SIK1이 DSRCT 세포의 DNA 복제에 필수적이다

A, B) RNA-seq 및 마이크로어레이 분석

• EWSR1-WT1 또는 SIK1을 각각 억제했을 때 공통적으로 변화한 유전자들을 비교했을 때, 가장 강하게 억제된 경로가 "염색체 복제의 세포주기 조절(cell cycle control of chromosomal replication)"이었다.

• 즉, 두 유전자는 같은 세포주기 조절 네트워크를 담당한다는 뜻이다.

C) 세포주기 흐름 분석 (Fig. 4C)

• DSRCT 세포주 (JN, BER) 에서 SIK1을 억제하면 세포가 G1/S 전이 단계에서 멈추고 S 기 진입이 완전히 차단됐다.

• 대조군에서는 정상적으로 S 기 진행이 일어났다.

• Cyclin E 단백질은 보통 S 기에 들어가면 감소하지만, SIK1 억제 세포에서는 항상 높게 유지돼 세포주기가 멈춰 있음을 의미했다.

D) DNA 복제 측정 (EdU 염색)

• SIK1 억제 세포는 DNA 복제가 거의 완전히 정지했다.

• BER 세포에서 EdU 양성률이 거의 0으로 감소했고, JN 세포에서도 유의한 감소 관찰

• 대조군 세포 (shRenilla 또는 -dox 처리군)에서는 DNA 복제가 정상적으로 유지됐다.
  → SIK1 없이는 암세포가 DNA를 복제하지 못한다는 것이 명확히 입증됐다.

E) MCM2 인산화 분석

• SIK1이 복제 헬리케이스인 MCM2를 인산화함으로써 DNA 복제를 시작한다는 기존 연구를 바탕으로, 세 개의 부위(S27, S41, S139)를 조사했다.

• S27, S41 부위의 인산화가 현저히 감소했으며, S139 에서는 변화가 없었다.

• 또한 SIK1 억제 세포에서 MCM2 단백질의 총 양 자체가 줄어들어, SIK1이 MCM2의 안정성 또는 발현을 조절할 가능성이 제시됐다.

• 동일한 현상은 범-SIK 억제제 YKL-05-099을 처리했을 때도 재현됐다.

 

결론

• SIK1은 DSRCT의 생존과 증식에 필수적인 인산화효소이다.

• EWSR1-WT1 융합 단백질이 SIK1을 직접 활성화해 DNA 복제 및 세포 증식을 유도한다.

• SIK1을 억제하면 세포 주기가 G1/S에서 멈추고, DNA 복제가 차단되며, 종양 성장이 중단된다.

• 동물 모델에서도 동일한 효과가 확인되어 실제 치료 표적으로서의 가능성이 매우 높다.

• CHEK1 억제제와의 병용은 암세포 선택적 독성을 강화하며 향후 DSRCT 치료에서 "SIK1 + CHEK1 이중 차단" 전략이 유망한 병용요법으로 제시된다.