Cyclin D1–CDK4/6–RB 경로가 DSRCT 치료 표적이 될 수 있다

Comprehensive Transcriptomic Analysis of EWSR1::WT1 Targets Identifies CDK4/6 Inhibitors as an Effective Therapy for Desmoplastic Small Round Cell Tumors (2024)

https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-23-3334

 

이 연구는 유잉형 소원형세포육종(Desmoplastic Small Round Cell Tumor, DSRCT) 의 원인 유전자인 EWSR1::WT1 융합 단백질이 종양 성장에 필수적이라는 점을 입증하고, 그 하위 신호 경로를 표적으로 삼아 새로운 치료 전략을 제시했다. DSRCT는 매우 공격적인 소아암으로, 기존의 화학요법·방사선·수술을 병행하는 치료법에도 불구하고 5년 생존율이 15~25%에 불과하다. 본 연구는 DSRCT의 핵심 분자 경로를 규명하고, 이미 유방암 치료제로 승인된 CDK4/6 억제제 팔보시클립(palbociclib) 이 DSRCT에서도 효과를 보임을 실험적으로 확인했다

 

연구 방법

1) 세포주 제작

• 4종의 DSRCT 세포주(JN-DSRCT-1, BER-DSRCT, BOD-DSRCT, SK-DSRCT2)에 doxycycline 유도형 shRNA 시스템을 구축해 EWSR1::WT1을 억제

• EGFP를 함께 발현시켜 유전자 억제 여부를 시각적으로 확인

2) in vitro 실험

• shRNA로 융합 단백질을 억제한 뒤, 세포 생존률·콜로니 형성·세포주기 변화를 분석

• RNA-seq으로 유전자 발현 변화를 포괄적으로 측정

3) in vivo 실험

• NSG 마우스에 DSRCT 세포를 이식해 종양을 형성시킨 후, doxycycline을 투여한 군과 대조군의 종양 성장을 비교

4) 후속 분석

• RNA-seq에서 상향 조절된 유전자 중 약물로 조절 가능한(druggable) 후보를 추출

• 각 유전자의 억제제를 DSRCT 세포주에 투여하여 생존율 변화를 측정

5) 기전 분석

• EWSR1::WT1 단백질의 DNA 결합 위치를 확인하기 위해 ChIP-seq 데이터를 분석

• CCND1 프로모터 영역 결합 여부를 검증하여 전사 조절 기전을 규명

 

연구 결과

1) EWSR1::WT1의 필수성 입증

• 융합 단백질 억제로 모든 세포주에서 세포 성장과 콜로니 형성이 현저히 감소

• 생쥐 모델에서 doxycycline 투여군의 종양 부피와 무게가 크게 줄었으며, 생존율이 증가

• 종양 조직은 대부분 섬유화되어 살아 있는 암세포가 거의 사라짐

2) 전사체 변화

• RNA-seq 결과, 175개의 공통 상향 유전자와 166개의 공통 하향 유전자가 확인됨

• 상향된 경로: 세포주기 전이(G1–S, G2–M), DNA 복제, 신경 발달·축삭 형성 등

• 하향된 경로: 세포 분화, 이동성, 세포외기질 형성 등

• WT1 또는 다른 융합 단백질과는 완전히 다른 전사 조절 패턴을 보였음

3) 약물 스크리닝 결과

• 175개 상향 유전자 중 약물 표적 22개를 선별

• 팔보시클립(palbociclib), UNC2250, KN93이 DSRCT 세포에서 강한 세포독성을 유발

• 특히 팔보시클립은 정상세포에는 거의 영향을 주지 않으면서 DSRCT 세포의 생존을 현저히 억제

• IC₅₀: 0.03~0.25 μM 범위, 100 nM 농도에서도 75~95% 성장 억제

4) 기전 규명

• EWSR1::WT1은 Cyclin D1(CCND1) 프로모터에 직접 결합해 전사를 활성화

• CCND1의 활성화는 CDK4/6을 자극해 RB 단백질을 인산화시키며, 세포주기 G1→S 전이를 유도

• 팔보시클립은 이 경로를 차단해 RB 탈인산화 및 G1기 정지를 유도

5) 아이소폼(E−KTS, E+KTS) 기능 비교

• E−KTS 형태가 전사활성의 대부분을 담당하며, CCND1·CALM1·CAMK2A·MERTK 발현을 크게 증가

• E+KTS 형태는 전사활성이 약해, DSRCT의 병리적 전사 변화는 주로 E−KTS 형태에 의해 발생

6) 팔보시클립의 생체 효과

• 팔보시클립(75 mg/kg)을 투여한 마우스에서 종양 성장률과 최종 종양 질량이 모두 감소

• RB 단백질의 탈인산화가 확인되어 CDK4/6 억제 작용이 입증됨

• 체중 변화 등 부작용은 미미했음

 

 

팔보시클립에 의한 EWSR1::WT1 활성화 세포 증식 억제

A) RB1 단백질의 shRNA knockdown 결과

• doxycycline을 처리하자 RB 단백질 발현이 줄어든다.

• 이 시스템은 팔보시클립의 작용이 실제로 RB 단백질 의존적인지를 확인하기 위한 실험적 장치다.
  → 즉, 팔보시클립이 RB가 없는 세포에서도 효과가 있는지 테스트하기 위한 준비 단계

B) 콜로니 형성 실험(Colony formation assay)

• RB가 있는 세포에서는 팔보시클립 처리 시 콜로니 형성이 거의 사라진다.

• 그러나 RB를 제거(shRB1)한 세포에서는 팔보시클립의 억제 효과가 사라진다.
  → 팔보시클립의 세포 성장 억제 효과가 RB 단백질에 의존함을 명확히 증명함

• Abemaciclib은 RB가 없더라도 일부 억제 효과를 보였는데, 이는 비특이적(off-target) 작용이 포함되어 있음을 시사한다.

C) 환자 유래 DSRCT 종양에서의 유전자 발현 분석 (Microarray)

• CCND1(사이클린 D1)이 CCND2, CCND3보다 훨씬 높게 발현됨

• CDK4 발현도 CDK6보다 높음
  → 즉, EWSR1::WT1은 Cyclin D1–CDK4 축을 선택적으로 강화시키는 경향이 있다.

D) EWSR1::WT1 억제 시 경로 구성 유전자 발현 변화 Heatmap

• shRNA로 EWSR1::WT1을 억제하면 CCND1 발현이 급격히 떨어짐

• 다른 구성요소(CDK4, CDK6, RB)는 큰 변화가 없음
  → 즉, EWSR1::WT1이 직접적으로 제어하는 핵심 표적은 Cyclin D1 임을 보여줌

E) CCND1 유전자 억제(shCCND1) 결과 Western blot

• doxycycline을 투여해 Cyclin D1 단백질이 줄어드는 것을 확인

• 실험적으로 Cyclin D1 축이 억제되었음을 입증

F) CCND1 억제 시 콜로니 형성 결과

• Cyclin D1이 줄어들면 세포 증식이 억제되고 콜로니 수가 급감
  → Cyclin D1이 종양 성장에 직접적으로 기여함을 보여줌

G) 세포주기 분석 (Flow cytometry)

• CCND1을 억제하면 세포가 G1기에 머무르고 S기 진입이 차단됨
  → 세포주기 진행이 멈춘다는 의미로, CDK4/6 억제가 G1 정지를 유도함을 명확히 시각화함

H) RB 인산화 상태 확인 (pRB S708 Western blot)

• Cyclin D1이 줄어든 세포에서는 RB의 인산화 수준이 급격히 낮아짐

• 이는 팔보시클립과 동일한 효과로, "EWSR1::WT1 → CCND1 → CDK4/6 → RB 인산화"의 연결 고리가 실제로 작동함을 입증한다.

 

연구 결론

이 연구는 DSRCT의 성장과 생존이 EWSR1::WT1–Cyclin D1–CDK4/6–RB 축에 의해 조절된다는 것을 명확히 밝혔다. 이 경로를 차단하는 CDK4/6 억제제 팔보시클립(palbociclib) 은 기존 유방암 치료제로 승인된 약물로, DSRCT에서도 강력한 항종양 효과를 보였다. 즉, 팔보시클립은 희귀 소아암인 DSRCT를 위한 즉시 임상 적용 가능한 표적 치료 후보로 제시됐으며, 연구진은 조속한 임상시험 진행의 필요성을 강조했다.