Desmoplastic small round cell tumor is dependent on the EWS-WT1 transcription factor (2020)

https://doi.org/10.1038/s41389-020-0224-1

 

연구 배경

Desmoplastic Small Round Cell Tumor(DSRCT)는 주로 청소년 및 젊은 남성에게서 발생하는 매우 공격적인 연부조직 악성종양이다. 대부분 복강 내 여러 결절 형태로 발견되며, 진단 당시 이미 광범위한 전이를 동반한다. 현재까지 알려진 치료법은 항암화학요법, 수술, 방사선치료의 병용이지만 장기 생존율은 극히 낮다. 평균 생존기간은 약 17개월, 5년 생존율은 20% 미만이다.

 

이 종양의 핵심 분자적 특징은 염색체 전좌 t(11;22)(p13;q12)로, EWSR1 유전자의 전사활성 영역과 WT1 유전자의 DNA 결합 영역이 융합되어 EWS-WT1 융합 단백질을 만든다. 이 단백질은 종양 진단의 결정적 지표이며, 발암의 중심적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 그러나 실제로 DSRCT 세포가 EWS-WT1의 지속적 발현에 얼마나 의존하는지는 명확히 규명되지 않았다. 또한, EWS-WT1이 하위에서 조절하는 유전자 네트워크에 대한 포괄적 분석도 없었다.

 

이 연구는 이러한 공백을 메우기 위해 EWS-WT1만을 특이적으로 억제하는 방법을 개발하고, 이를 통해 DSRCT가 실제로 이 단백질에 생존을 의존하는지를 입증했다.

 

연구 방법 (개조식)

1) 세포주 및 배양 조건

• 사용 세포주: BER 및 JN-DSRCT-1 (모두 인간 DSRCT 유래)

• EWS-WT1 전좌 확인: FISH 분석으로 확인

• 배양 조건

  • RPMI-1640 배지

  • 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin

  • 37°C, 5% CO₂ 환경

2) EWS-WT1 선택적 억제 전략

• 문제점: EWSR1과 WT1의 정상 단백질이 함께 발현되므로 융합단백질만 선택적으로 억제하기 어려움

• 해결책: EWS-WT1 융합부위를 양쪽에서 동시에 표적하는 맞춤형 siRNA 2종 설계

• siRNA 농도 조절

  • 2 nmol/L에서 EWS-WT1만 억제

  • 높은 농도에서는 정상 EWSR1·WT1 발현도 감소하므로 배제

• 확인 방법: Western blot으로 발현 확인

3) 세포 증식 및 생존 평가

• 세포 증식 측정: Incucyte Zoom 장비로 2시간 간격 실시간 모니터링

• 비교군

  • 미처리군 (Media)

  • 비표적 siRNA군 (siNeg)

  • 양성 대조군 (siDeath)

• 통계 분석: t-test 및 다중 비교 보정 수행

4) 형태 변화 및 세포사멸 분석

• EWS-WT1 억제 후 시간대별 세포 형태 관찰 (16~96시간)

• Apoptosis 분석

  • Cleaved PARP 단백질 검출 (Western blot)

  • Caspase-3/7 활성화 측정 (형광 지표 사용)

• 세포사멸 시점: 억제 60~72시간 이후

• 특징: 성장 정지 후 2차적으로 세포사멸 발생

5) RNA 시퀀싱 및 차등 유전자 발현 분석

• 시점: EWS-WT1 억제 48시간 후 (2차적 사멸 영향 최소화 시점)

• RNA 추출: Qiagen QiaCube 사용

• 라이브러리 제작: KAPA-stranded mRNAseq kit

• 분석 툴: STAR aligner, DESeq2, apeglm

• 통계 기준: q-value < 0.05, |log₂FC| > 2

• 반복: 각 세포주 3개 생물학적 반복 수행

6) 기능적 유전자 세트 분석(GSEA)

• 사용 툴: fgsea 패키지

• 분석 기준: Hallmark 및 KEGG 유전자 세트 기반

• 공통 상위 경로 식별

  • 세포주기 조절, DNA 복구, MYC, E2F, TGFB, PRC2 등

7) 단백질 수준 검증

• RNA-seq에서 관찰된 주요 유전자 중 일부를 Western blot으로 검증

  • ERG (유도형, 발현 증가)

  • CEBPD (억제형, 발현 감소)

• 항체

  • EWSR1 (Cell Signaling #11910)

  • WT1 (Santa Cruz sc-7385)

  • ERG (Abcam ab92513)

  • CEBPD (Abcam ab65081)

 

연구 결과

1) EWS-WT1 억제 → 세포 증식 정지

• siRNA 처리 후 48시간 이내 EWS-WT1 단백질 소실

• 두 세포주 모두 세포 밀도 급격히 감소

• 미처리군과 siNeg군은 정상 증식 유지
  → EWS-WT1은 DSRCT 세포 증식에 필수적임이 입증됨

2) 형태 변화 및 세포사멸 유도

• 억제 24~48시간: 세포 커지고 납작해짐 (분화유사 형태)

• 억제 60~72시간: PARP 절단 및 caspase-3/7 활성화
  → 성장 정지 이후 2차적 apoptosis 진행

3) 전사체 변화

• 총 1,879개 유전자 발현 변화 (±2 log₂FC 이상)

• 억제된 유전자가 유도된 유전자보다 많음

• 두 세포주 공통 변화 유전자

  • 68개 유도형(up-regulated)

  • 223개 억제형(down-regulated)

• 주요 경로 변화

  • FGFR4, JAK3, IGF, Wnt, PDGFA, BAIAP3 등

• 단백질 수준에서도 ERG 증가, CEBPD 감소 확인

4) 기능적 경로 분석(GSEA)

• MYC 활성 억제 → 세포 증식 저하

• 에스트로겐 신호 억제 → 남성 중심 발병과 부합

• TP53 신호 억제 + DNA 복구 경로 활성화 → 항암제 저항성 기전 가능성

• PRC2 복합체 조절 이상 → 후성유전적 발암 메커니즘 시사

• E2F 및 TGFB, mTOR, IGF 신호 경로 이상 → 다른 육종과 공통점 확인

5) EWS-FLI1과의 유사성

• 유잉 육종의 EWS-FLI1과 EWS-WT1은 구조적으로 다르지만 공통된 유전자 조절 패턴을 보임

• 공통 조절 경로: PRC2, TGFB, IGF, E2F, mTOR

• 일부 EWS-FLI1 표적 유전자도 EWS-WT1 억제 시 발현 변화 관찰 (>0.5 log₂FC)

6) ERG의 핵심 역할

• EWS-WT1은 ETS 계열 전사인자 ERG를 유도함

• ERG 억제 시

  • 세포 증식 급격히 저하

  • caspase 활성화 → apoptosis 유도
    → ERG는 EWS-WT1 하위 전사 네트워크의 핵심 매개자

7) DNA 손상 복구 관련 특징

• EWS-WT1 억제 후 Hallmark_DNA_repair 세트의 NES = -1.8, p = 0.0023

• 해당 세트에는 nucleotide excision repair 및 transcription-coupled repair 관련 유전자 포함

• EWS-WT1은 TP53 억제와 동시에 DNA 복구 경로를 과활성화
  → 화학요법 내성의 분자적 근거 제시

 

 

EWS-WT1 억제가 DSRCT 세포의 증식 정지를 유도한다

(a) 단백질 발현 억제의 특이성

• 연구진은 EWS-WT1만 선택적으로 억제하는 siRNA를 설계했다.

• 그림의 왼쪽에는 Western blot 결과가 나타나 있다.

• EWS-WT1 단백질은 siRNA 처리 후 확실히 사라졌지만 정상형 EWSR1과 WT1 단백질은 그대로 유지되었다.

(b) 억제 시간에 따른 EWS-WT1 소실 과정

• JN-DSRCT-1 세포에서 siRNA 처리 후 시간별 단백질 발현 변화를 관찰했다.

• 0시간에서는 EWS-WT1이 강하게 발현되지만, 48시간이 지나면 거의 완전히 사라진다.

• 이는 EWS-WT1 단백질이 빠르게 분해되고 세포가 그에 적응하지 못한다는 것을 보여준다.

(c), (d) 세포 증식 곡선 변화

• 두 개의 DSRCT 세포주(JN-DSRCT-1, BER)에 siRNA를 처리하고 세포 밀도(=세포 증식 정도)를 시간에 따라 측정했다.

• 결과

  • 대조군(비표적 siRNA, 미처리 세포)은 일정하게 증식함

  • EWS-WT1 억제군은 48시간 이내에 세포 증식이 완전히 멈춤

• 세포 성장 곡선이 수평으로 꺾이면서 EWS-WT1이 사라지면 세포가 더 이상 나누어지지 못한다는 사실을 명확히 보여준다.

 

연구 결론

EWS-WT1 억제는 DSRCT 세포의 증식 정지와 apoptosis를 유도했으며, 전사체 분석 결과 EWS-WT1이 FGFR4, JAK3, IGF, mTOR, TGFB, ERG 등 세포 생존 신호를 활성화하고 TP53 경로를 억제하는 핵심 전사인자임이 밝혀졌다. 또한 EWS-WT1은 유잉 육종의 EWS-FLI1과 유사한 전사 네트워크를 공유해, 두 종양이 공통된 발암 기전을 가질 가능성이 제시됐다. 결국 DSRCT는 EWS-WT1 단백질에 생존을 절대적으로 의존하는 종양이며, 이를 직접 혹은 간접적으로 차단하는 표적치료 전략이 DSRCT 치료의 핵심 접근점이 될 수 있음을 보여줬다.