Vitamin D deficiency causes insulin resistance by provoking oxidative stress in hepatocytes (2017)

https://doi.org/10.18632%2Foncotarget.18754

 

인슐린 저항성은 제2형 당뇨병을 비롯한 다양한 대사 질환의 주요 원인 중 하나로, 비타민 D의 부족이 이러한 상태를 악화시킬 수 있다. 해당 논문은 비타민 D 결핍이 간세포에서 산화 스트레스를 유발하여 인슐린 저항성을 촉진하는 구체적인 메커니즘을 밝히는 연구이다.

 

연구 방법

비타민 D 활성화에 중요한 역할을 하는 1α-하이드록실라제(1α(OH)ase) 효소를 억제하여 비타민 D 결핍을 유도한 후, 인간 간세포(L02 세포주)에서 발생하는 생리적 변화를 분석하였다. 연구팀은 두 가지 방법으로 1α(OH)ase를 억제하여, 인슐린 신호 전달 및 포도당 수송체 4(GLUT4) 발현의 변화를 관찰하였다. 또한, 항산화제인 N-아세틸시스테인(NAC)을 사용하여 산화 스트레스의 영향을 평가하였다.

 

연구 요약

1. 비타민 D 결핍 유도: 1α(OH)ase를 억제함으로써 간세포 내 비타민 D3 수준이 크게 감소했다.

2. 인슐린 저항성: 비타민 D 결핍이 유도된 세포에서는 인슐린이 유도하는 신호전달(IRS-1, ERK1/2, AKT)의 활성화가 저해되었으며, 포도당 수송체 GLUT4의 발현이 감소하였다. 이는 인슐린 저항성의 주요 특징이다.

3. 산화 스트레스 유발: 1α(OH)ase가 억제된 세포에서 활성 산소종(ROS) 생성이 증가하였고, p53-p21 신호전달 경로의 활성화와 DNA 손상이 관찰되었다.

4. NAC의 효과: NAC와 함께 처리했을 때, ROS 생성이 억제되고, p53-p21 신호전달 경로의 활성화와 DNA 손상이 대부분 사라졌다. 또한, 인슐린 신호전달과 GLUT4 발현도 회복되었다. 이는 산화 스트레스가 비타민 D 결핍으로 인한 인슐린 저항성의 주요 원인임을 시사한다.

 

연구 방법

1. 비타민 D 결핍 모델 구축

   • 1α-하이드록실라제(1α(OH)ase) 억제

     • 비타민 D3의 활성화에 중요한 효소인 1α(OH)ase를 억제하기 위해 인간 간세포(L02 세포주)에 shRNA를 사용하여 1α(OH)ase 유전자를 침묵시켰다.

     • 두 가지 다른 shRNA 서열을 사용하여 1α(OH)ase의 발현을 억제하였으며, 이로 인해 세포 내 비타민 D3 수준이 감소하였다.

2. 세포 배양 및 처리

   • L02 세포주 배양

     • RPMI 1640 배지에 10% FBS와 항생제를 첨가하여 L02 간세포를 배양하였다.

     • 세포는 37°C, 5% CO₂ 조건에서 유지되었다.

   • shRNA 도입 및 안정적 세포주 확립

     • Lentiviral 벡터를 통해 shRNA를 세포에 도입하고, 퓨로마이신(puromycin)으로 선택하여 1α(OH)ase가 안정적으로 억제된 세포주를 확립하였다.

3. 비타민 D3 수준 측정

   • ELFA 분석: ELFA(Enzyme Linked Fluorescent Assay) 키트를 사용하여 배양 조건에서 세포 배양액의 비타민 D3 농도를 측정하였다.

4. 인슐린 저항성 평가

   • 인슐린 신호 전달 분석

     • 인슐린 처리(1 μg/mL, 10분) 후, Western blotting을 통해 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1), ERK1/2, AKT의 인산화 수준을 평가하였다.

     • 포도당 수송체 4(GLUT4)의 발현 변화를 분석하여 인슐린 저항성을 확인하였다.

5. 산화 스트레스 및 항산화제 처리

   • ROS(활성 산소종) 측정: DCFH-DA 형광 염색을 사용하여 세포 내 ROS 수준을 측정하였다.

   • 항산화제 N-아세틸시스테인(NAC) 처리: NAC(500 μM)를 매일 신선하게 교체하며 10일간 세포에 처리하여 산화 스트레스를 억제하였다.

   • 지질 과산화 측정: TBAR(Thiobarbituric Acid Reactive Substances) 분석을 통해 지질 과산화 수준을 측정하였다.

6. 세포 손상 및 DNA 손상 평가

   • p53-p21 신호 경로 분석: Western blotting을 통해 p53-p21 신호 전달의 활성화를 평가하였다.

   • DNA 손상 평가: γ-H2AX FACS 분석을 통해 DNA 손상 정도를 평가하였다.

 

 

연구 결과

1. 1α(OH)ase 억제에 따른 비타민 D3 감소

   • 1α(OH)ase를 억제한 L02 간세포에서는 비타민 D3 수준이 유의미하게 감소하였다.
   • Western blotting과 qRT-PCR 결과, 1α(OH)ase 단백질과 mRNA 발현이 각각 억제되었으며, 이는 비타민 D3 결핍 상태를 성공적으로 유도한 것을 의미한다.

2. 인슐린 저항성 유발

   • 1α(OH)ase가 억제된 간세포에서는 인슐린에 의한 신호 전달이 저해되었다.
   • 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1), ERK1/2, AKT의 인산화 수준이 감소하였으며, GLUT4 발현도 감소하였다.
   • 이는 인슐린 신호 전달 경로가 손상되어 인슐린 저항성이 유발되었음을 나타낸다.

3. 산화 스트레스 증가

   • 1α(OH)ase 억제에 의해 세포 내 ROS 수준이 증가하였으며, SOD(슈퍼옥사이드 디스뮤타아제) 활성은 감소하였다.
   • 지질 과산화(Lipid peroxidation) 역시 증가하여 산화 스트레스가 현저히 높아졌다.
   • 이러한 산화 스트레스는 p53-p21 신호 경로의 활성화와 함께 DNA 손상을 유발하였다.

4. NAC에 의한 산화 스트레스 및 인슐린 저항성 회복

   • NAC 처리 후, ROS 생성이 억제되었으며, 지질 과산화 및 p53-p21 활성화가 거의 완전히 차단되었다.
   • NAC와 함께 처리된 세포에서는 인슐린 신호 전달 경로의 활성화가 회복되었으며, GLUT4 발현도 정상 수준으로 회복되었다.
   • 이는 산화 스트레스가 인슐린 저항성의 주요 원인임을 시사하며, NAC를 통한 항산화 처리가 인슐린 감수성을 회복시킬 수 있음을 보여준다.

 

연구 결론

이 연구는 비타민 D 결핍이 산화 스트레스를 통해 인슐린 저항성을 유발할 수 있다는 중요한 사실을 밝혔다. 이는 제2형 당뇨병 및 대사 질환 환자들에게 비타민 D 섭취의 중요성을 강조하는 근거가 될 수 있다. 특히, 비타민 D가 부족한 사람들은 체내 산화 스트레스를 줄이기 위해 항산화제 섭취와 같은 대책을 고려할 필요가 있다. 적절한 비타민 D 보충은 인슐린 감수성을 개선하고 대사 건강을 유지하는 데 도움이 될 수 있다.

비타민 D는 햇빛, 식품(특히 지방이 많은 생선, 달걀 노른자 등) 및 보충제 등을 통해 충분히 섭취할 수 있다. 만약 비타민 D 결핍이 의심된다면, 건강 검진을 통해 비타민 D 수치를 확인하고, 필요한 경우 의사와 상담하여 보충제를 복용하는 것이 좋다. 이와 함께, 규칙적인 운동과 균형 잡힌 식단으로 체내 산화 스트레스를 줄이는 것도 중요하다.

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